Começou sua carreira aos onze anos de idade, em uma companhia de teatro de Nova Iorque. Nessa fase, chegou a interpretar papéis de William Shakespeare. Conta-se que conseguiu entrar na companhia escrevendo uma carta para o diretor. Mais tarde, ela voltaria a interpretar Shakespeare em filmes modernizados para a "geração MTV". Stiles apareceu no clipe musical "Sally's Pigeons" de Cyndi Lauper em 1993.

Iniciou no cinema através do filme I Love You, I Love You Not, em 1996. No ano seguinte, obteve seu primeiro papel relevante em The Devil's Own, ao lado de Harrison Ford e Brad Pitt. Em 1999, atingiu o estrelato com o filme 10 Things I Hate About You, uma adaptação da obra de Shakespeare A Megera Domada. O sucesso fez dela uma das mais cobiçadas mulheres com menos de 21 anos dos Estados Unidos.

Prosseguindo em adaptações de Shakespeare, ela fez Hamlet, em 2000, confirmando seu potencial em obras dramáticas e clássicas. Em 2001, atuou em uma interessante produção de cinema ao estilo MTV: Save the Last Dance. Com isso, consolidou-se como atriz e voltou a ser considerada uma das mulheres mais belas do mundo.

Ainda em 2001, ela foi uma das apresentadoras do Oscar 73. Ela também esteve em Saturday Night Live, aparecendo como Jenna filha do então presidente George W. Bush,

Em 2003, participou do filme A Guy Thing, uma comédia romântica que tinha também no elenco Jason Lee, Selma Blair e entre outros. Esteve também em Mona Lisa Smile, como Joan, uma estudante da Wellesley College, cuja professora Katherine Watson (Julia Roberts) encoraja a prosseguir uma carreira na lei, em vez de se tornar uma esposa e mãe.

Até então, porém, ela ainda não havia participado de grandes produções de Hollywood. Isso aconteceu com três filmes: The Bourne Identity, The Bourne Supremacy e The Bourne Ultimatum, ao lado de Matt Damon, respectivamente em 2002, 2004 e 2007.

Em 2004, ela fez sua estreia nos palcos de Londres junto com Aaron Eckhart em uma revival da peça Oleanna de David Mamet no Teatro Garrick.

Em 2005, Stiles foi escalada para o filme The Omen, um remake do filme de terror de 1976. O filme foi lançado em 06 de junho de 2006.

Em 2007, Stiles fez sua estreia na direção com o curta Raving, estrelado por Zooey Deschanel. Ela estreou no Festival de TriBeCa de 2007.

Stiles também aparece no filme de 2008 Gospel Hill. Ela retratou uma mulher que se apaixona por seu perseguidor no filme The Cry of the Owl de 2009, baseado no romance de Patricia Highsmith.

Ela repetiu o papel de Carol em uma produção de 2009, dirigido por Doug Hughes e co-estrelado por Bill Pullman no Mark Taper Forum. Em 30 de junho de 2009, foi anunciado que esta produção seria transferida a John Golden Theatre.

Em 2010, Julia fez parte do elenco da quinta temporada da série Dexter do canal pago Showtime, como a misteriosa Lumen Pierce, papel que acabou lhe rendendo uma indicação ao Golden Globe Award de melhor atriz coadjuvante em televisão e uma indicação ao Emmy de Melhor Atriz Convidada em Drama.

Sempre obteve boa repercussão da crítica. Na condição de democrata convicta, possui intensa atividade política, como por exemplo, a defesa da legalização do aborto.

Stiles vai interpretar Jeannie em uma produção de Neil LaBute chamada Fat Pig que e dirigido pelo dramaturgo, que será iniciado em abril de 2011.

Stiles esteve no filme Between Us, que tem no elenco também Taye Diggs, David Harbour e Melissa George. Between Us é a adaptação cinematográfica da off-Broadway peça de mesmo nome escrito pelo dramaturgo Joe Hortua. O filme estreou no Festival de Cinema de Berlim, onde seus produtores esperavam encontrar um distribuidor nacional. O filme já exibido em 15 festivais de cinema, ganhando o prêmio do júri no Festival de Cinema de Bahamas.